来源/预立医学
今天为大家带来的文章是近期发表在Oncotarget上一篇文章，作为一篇microRNA二代测序的范文，具有一定的参考价值。这篇文章的题目是：Next-generationsequencingidentifiesarticularcartilageandsubchondralbonemiRNAsafterESWTonearlyosteoarthritisknee，影响因子5.。
期刊介绍Oncotarget
IF：5.
出版周期：双月刊
审稿周期：平均2.2月
偏重方向：肿瘤、基因、靶向治疗、自噬、干细胞、衰老等
研究亮点通过二代测序验证了预测的靶基因与多种生物学功能相关，包括软骨发育、炎症、免疫反应、血管再生、细胞粘附、细胞周期、转录翻译、基因表达、NTP结合、信号转到、胶原纤维、凋亡、软骨细胞分化、细胞分化、骨生长及细胞增殖等；
文章评价了ESWT治疗后关节软骨和软骨下骨的miRNA的表达模式。为关节炎和ESWT疗法提供了潜在的新的标志物和治疗策略；
本文为高通量测序研究的一般思路，借鉴作用较强。
研究思路作者首先通过切除小鼠前交叉韧带及内侧半月板制作早期关节炎（OA）模型，并对部分小鼠行体外冲击波治疗（ESWT）。
软骨和骨分别分三组开展实验，sham为正常对照组，OA为关节炎组，OA+SW为ESWT治疗组。每组选用四只小鼠，取其软骨组织及软骨下骨组织，提取RNA进行高通量测序，检测其miRNA表达谱。
分别对软骨及软骨下骨展开分析，并对实验设置的3组数据两两进行比较，寻找差异表达的miRNA，并预测其靶基因及潜在功能。作者对于认为比较重要的miRNA，开展了RT-PCR实验，进一步分析三组中软骨及骨组织的表达差异。
研究结果OA的原发病变在关节软骨，蛋白多糖是其主要成分之一。作者在造模完成后，首先做了免疫组化，检测造模是否成功。染色剂为番红素O，软骨蛋白多糖会被染成红色，而软骨下骨为蓝色。OA组红色明显缺失，图中用黑色箭头指示。
作者分别取三组的关节软骨及软骨下骨组织，提取RNA，进行高通量测序，检测miRNA，并进行聚类分析。左图为软骨中3组样品miRNA的表达谱，有图为软骨下骨组织的表达谱（红色为表达上调，蓝色表达下调）。
不论是软骨还是骨组织，三组中miRNA的表达模式都存在较大差异。且ESWT治疗后，软骨与骨中，激活或抑制的miRNA是不同的。
作者采用ShamvsOA、ShamvsOA+WT、OAvsOA+WT的分析方法对数据进行分析，找出了三组分析中显著上调及显著下调的miRNA。
接着，通过PCA分析，发现在6个组（软骨与骨各3组：ShamvsOA、ShamvsOA+WT、OAvsOA+WT）中，是完全分开的，并且ESWT处理后，软骨和骨的miRNA表达关联性增强。变异位点来源分析，ESWT处理组是主要的来源。
作者挑选4种miRNA在软骨和骨组织中进行RT-PCR实验，这4种miRNA与多种因子相关，如蛋白聚糖、VEGF、MMP13、代谢作用等。
TargetScan进行靶基因预测，UniProt数据库进行功能注释，显著上调和下调的miRNA主要与以下功能相关，包括软骨发育、炎症、免疫反应、血管再生、细胞粘附、细胞周期、转录翻译、基因表达、NTP结合、信号转到、胶原纤维、凋亡、软骨细胞分化、细胞分化、骨生长及细胞增殖等。并且ESWT治疗后，表达发生改变的miRNA主要参与软骨发育与骨重建这两个功能。
这篇文章中规中矩，代表了高通量测序类文章的一般思路，不仅适用于骨关节炎，对于其他领域的精准医疗都有较强的借鉴作用。
高通量测序到底是什么呢？高通量测序技术（High-throughputsequencing）又称“下一代”测序技术（"Next-generation"sequencingtechnology），能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。
目前较常用的平台，Roche是焦磷酸测序、IlluminaSolexa是合成测序、ABISOLiD是连接测序。Roche读长最长，便于拼接；SOLiD读长短但Reads数多，且每个碱基读取2遍，准确率较高；IlluminaSolexa读长、Reads数及准确率居中，但是其成本较低，目前应用较为广泛。
高通量测序能做什么呢？在基因组水平上对还没有参考序列的物种进行从头测序(denovo)，获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；对有参考序列的物种，进行全基因组重测序及外显子组测序，扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。
在转录组水平上进行全转录组测序，从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究；进行非编码测序(smallRNA)，如：小RNA、lncRNA、circRNA等，比较其表达差异及发现新的相关分子。
在表观遗传方面，结合重亚硫酸盐转化或免疫共沉淀等，可检测基因组上的甲基化位点。
在微生物领域，对16S或18S等核糖体RNA扩增测序，可分析其微生物多样性、物种丰度等；宏基因组测序可得到微生物的功能活性、相互协作关系及与环境之间的关系。
